Rolle des endothelialen kontraktilen Apparates bei der Entstehung eines Hirnödems nach Schädelhirntrauma und Subarachnoidalblutung

Zerebrale Erkrankungen, wie Schädelhirntrauma (SHT) und Subarachnoidalblutung (SAB) sind mit einer hohen Morbidität und Mortalität vergesellschaftet und stellen eine ernsthafte medizinische und ökonomische Herausforderung dar. Grundlage für die Entwicklung neuer effektiver Therapieansätze ist das Verständnis der pathophysiologischen Mechanismen dieser Krankheiten. Das Entstehen eines vasogenen Hirnödems ist eine schwere Komplikation nach SHT und SAB und beruht u.a. auf einem Öffnen der Bluthirnschranke (BHS). Ein möglicher zu Grunde liegender Mechanismus könnte die Aktivierung der Myosin-leichte-Kette-Kinase (MLCK) sein, was man therapeutisch unterbinden könnte.rnIn der vorliegenden Studie wurde in zwei unterschiedlichen experimentellen, zerebralen Schadensmodellen der Einfluss des kontraktilen Apparates auf die BHS Störung untersucht. In dem Schadensmodell des SHT sind die Hauptergebnisse: 1.) die Myosin-leichte-Kette-Kinase (MLCK) wird durch das induzierte Schädelhirntrauma hochreguliert. 2.) eine pharmakologische MLCK Inhibition stabilisiert die BHS, senkt den ICP und das Hirnödem nach experimentellen SHT. 3.) die MLCK Inhibition führte nicht zu einer Verbesserung des Hirnschadens, der neurologischen Funktion oder der zerebralen Inflammation 24 Stunden nach SHT, obwohl angenommen wird, dass die Entstehung eines Hirnödems den sekundären Hirnschaden vergrößert. In einer weitern Studie wurde untersucht, durch welchen Signalweg dieser zugrunde liegende Mechanismus aktiviert wird. In einem in-vitro BHS Model konnte gezeigt werden, dass C-reaktives Protein (CRP) über die Bindung an Fcγ-Rezeptoren den kontraktilen Apparat aktiviert und somit zu einem Öffnen der BHS führt. Obwohl der CRP Plasmaspiegel nach experimentellen SHT ansteigt, kommt es nicht zu einer Verringerungrndes Hirnwassergehaltes in FcγR-/- Mäusen. Die Entstehung des vasogenen Hirnödems wird im murinen CCI Model somit nicht über den Fcγ-Rezeptor vermittelt. Die in-vitro gezeigte Fcγ vermittelte Öffnung der BHS konnte in-vivo in dieser Studie nicht reproduziert werden. Mit der vorliegenden Studie kann nicht ausgeschlossen werden, dass CRP über einen Fcγ unabhängigen Mechanismus eine Öffnung der BHS vermittelt. Jedoch deuten die Daten daraufhin, das CRP im murinen CCI Model eine untergeordnete Rolle spielt. Die FcγR-/- Mäuse zeigten allerdings ein deutlich reduziertes Kontusionsvolumen und eine reduzierte Mikroglia Aktivierung, was darauf hindeutet, dass FcγR eine wesentliche Rolle bei der zerebralen Inflammation spielen.rnIn dem Schadensmodell der experimentellen SAB konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der MLCK die Folgen einer SAB mindert. Sie führt zu einer Senkung des Hirnödems, des intrakraniellen Drucks und Verbesserung der neurologischen Erholung nach experimenteller SAB. Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass die MLCK einer der Endpunkteffektor für verschiedene Mechanismen ist, welche die endotheliale Permeabilität sowohl nach SHT als auch nach SAB erhöhen.rnZusammenfassend lässt sich feststellen, dass in beiden zerebralen experimentellen Insulten die MLCK eine wichtige Rolle beim BHS Versagen spielt. Die Daten tragen dazu bei, den zugrundeliegenden Mechanismus der BHS Öffnung, der durch eine Aktivierung der MLCK hervorgerufen werden könnte, besser zu verstehen. Dies könnte zu Entwicklung neuer Medikamente für eine Therapie des zerebralen Hirnödems führen.

Untersuchungen zur Beeinflussung der Reparatur oxidativer DNA-Schäden durch Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, AP-Endonuklease 1 und das Xeroderma pigmentosum A Protein

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung der Bedeutung der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP 1), der AP Endonuklease 1 (Ape 1) und des Xeroderma pigmentosum A (XPA) Proteins für die DNA-Reparatur in Säugerzellen.Zunächst wurde der Einfluss der PARP 1-Aktivität auf die Reparatur verschiedener DNA-Modifikationen untersucht. Die Ergebnisse zeigen erstmalig, dass eine Hemmung der PARP-Aktivität nicht nur eine deutliche Verlangsamung der Reparatur von Einzelstrangbrüchen, sondern auch von oxidativen Purinmodifikationen und Pyrimidindimeren zur Folge hat. Interessanterweise erfolgte diese Verlangsamung der DNA-Reparatur nicht in Csb-defizienten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung der PARP 1 und das Csb-Protein zusammen an einem neuartigen Mechanismus beteiligt sind, der die globale Reparatur verschiedener DNA-Modifikationen beschleunigt.Weiterhin wurde die Bedeutung der Nukleotidexcisionsreparatur als back-up Reparatur von 8 Hydroxyguanin untersucht. Dazu wurden normale und XPA-defiziente Fibroblasten des Menschen mit einem hOgg1-anitsense Konstrukt transfiziert und dann in diesen Zellen die Reparaturkinetiken oxidativer Basenmodifikationen bestimmt. Dadurch konnte eine Beteiligung des XPA-Proteins an diesem Reparaturweg ausgeschlossen werden.Außerdem wurden die Auswirkungen einer AP Endonuklease-1-Überexpression in XRCC1-defizienten Zellen auf die Reparatur von Einzelstrangbrüchen untersucht. Die Reparatur der induzierten Einzelstrangbrüche war in XRCC1-defizienten Zellen erwartungsgemäß deutlich langsamer als in XRCC1-profizienten Zellen. Die Überexpression der AP Endonuklease 1 in XRCC1-defizienten Zellen führte zu einer teilweisen Beschleunigung der Einzelstrangbruchreparatur.

In vitro characterization of human AML-reactive CTL clones generated from the naive subset of healthy donors and adoptive transfer into leukemia-engrafted NSG mice

Acute myeloid leukemia (AML) is a very aggressive cancer of the hematopoietic system. Chemotherapy and immunotherapeutical approaches including hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) are the only curative options available. The beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect of cellular immunotherapy is mostly mediated by donor-derived CD8+ T lymphocytes that recognize minor histocompatibility antigens (mHags) and leukemia-associated antigens (LAAs) presented on the surface of AML blasts (Falkenburg et al. 2008; Kolb 2008). A main complication is graft-versus-host disease (GVHD) that can be induced when cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize broadly expressed antigens. To reduce the risk of GVHD, specific allogeneic T-cell therapy inducing selective GVL responses could be an option (Barrett & Le Blanc 2010; Parmar et al. 2011; Smits et al. 2011). This requires efficient in vitro strategies to generate AML-reactive T cells with an early differentiation phenotype as well as vigorous effector functions and humanized mouse models to analyze the anti-leukemic potential of adoptively transferred T cells in vivo. In this study, AML-reactive CTL clones and oligoclonal T-cell lines could be reliably generated from the naive subset of healthy HLA-class I-identical donors by stimulation with primary AML blasts in mini-mixed-lymphocyte / leukemia cultures (MLLCs) in eight different patient / donor pairs. These CTLs were promising candidates for cellular immunotherapy because of their relatively early differentiation phenotype and strong proliferative and lytic capabilities. The addition of the common γ-chain cytokine IL-21 to the stimulation protocol enabled more precursors to develop into potent leukemia-reactive CTLs, presumably by its beneficial effects on cell survival and antigen-specific proliferation during the first weeks of cultures. It also strengthened the early-stage phenotype. Three long-term cultured CTLs exemplarily transferred into leukemia-engrafted immunodeficient NSG mice mediated a significant reduction of the leukemic burden after a single transfusion. These results demonstrate that CTL clones with reactivity to patient-derived AML blasts can be isolated from the naive compartment of healthy donors and show potent anti-leukemic effects in vivo. The herein described allo-MLLC approach with in vitro “programmed” naive CTL precursors independent of a HSCT setting is a valuable alternative to the conventional method of isolating in vivo primed donor CTLs out of patients after transplantation (Kloosterboer et al. 2004; Warren et al. 2010). This would make leukemia-reactive CTLs already available at the time point of HSCT, when residual leukemia disease is minimal and the chances for complete leukemia eradication are high. Furthermore, leukemia-reactive CTLs effectively expanded by this in vitro protocol can be used as screening populations to identify novel candidate LAAs and mHags for antigen-specific immunotherapy.